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摘要

目的：Ki67是肿瘤增殖活性的标志物，对多种实体恶性肿瘤的预后有重要意义。我们试图探讨非小细胞肺癌患者肿瘤切除术后的Ki67表达、免疫细胞浸润和免疫检查点表达之间的关系。

方式：对1997-2012年间行I ~ III期非小细胞肺癌切除术的患者标本进行组织芯片分析。由表达Ki67的癌细胞百分比来定量增殖指数。对表达于恶性肿瘤细胞(程序性死亡配体1，B7H3，B7H4,吲哚胺2,3-dioxygenase 1)和淋巴细胞(t细胞免疫球蛋白和mucin-domain containing 3 ，V-domain suppressor of T-cell activation,肿瘤坏死因子受体4，淋巴细胞激活基因3,inducible T-cell co-stimulator)的检查点被基于瘤内和基质内进行独立分析。并在一个有代表性的亚群中，对瘤内和瘤周的免疫细胞密度进行量化。

结果：共有190例患者符合纳入标准。Ki67在鳞状细胞癌(恶性细胞阳性率为31.4%，腺癌阳性率为15.2%，P <.001)，晚期肿瘤(阶段II / III 25.7% vs 20.8%阶段I, P¼.013)，和低分化肿瘤(28.8%vs15.4%，P < .001)中呈高表达水平。Ki67水平与瘤内表达的程序性死亡配体1、B7-H3、吲哚胺2,3双加氧酶1，和基质表达的淋巴细胞激活基因3和诱导t细胞共刺激因子水平呈正相关。Ki67表达与CD57+和CD4+细胞的瘤内密度成负相关。在I期肿瘤中，Ki67与检查点表达的相关性最强。在I期患者中，Ki67升高独立地与整体生存率降低相关。

结论：Ki67表达升高与具有生物侵袭性的非小细胞肺癌、免疫检查点表达增强以及瘤内免疫细胞浸润减少有关。这些发现在早期疾病中最为明显，值得在新的治疗药物的背景下进行进一步的研究。(J Thorac Cardiovasc Surg 2019)

观点：Ki67是一种肿瘤增殖活性的生物标志物，已被证明与NSCLC的不良预后有关。通过分析Ki67的肿瘤表达，我们证实了肿瘤增殖的增加与免疫检查点的表达之间的联系。这些发现提示Ki67可作为早期NSCLC免疫抑制微环境的标志物。

免疫检查点阻断在非小细胞肺癌(NSCLC)治疗中的成功应用，使肿瘤与免疫细胞相互作用的重要性凸显出来。越来越多的证据表明，这些治疗方法的开发和应用是合理的，肿瘤的先天性和适应性反应的特征是代谢信号和免疫检查点的表达之间复杂的相互作用导致的，其在局部肿瘤微环境(TME)中具有免疫抑制或免疫激活作用 。随着这些新疗法在早期和晚期疾病的治疗中获得更广泛的临床应用，将需要对治疗效果进行预测，因为并非所有患者都会有效。增强对肿瘤细胞和免疫系统之间相互作用的理解可能有助于识别代表疗效的生物标志物。

Ki67是一种核蛋白，在有丝分裂过程中对核糖体RNA的合成和染色质结构的组织与维持，发挥作用。Ki67的致瘤特性已被提出，并作为一个潜在的治疗靶点被进一步探索。虽然它可以在整个细胞周期中被检测到，并且在静止细胞中以低水平的本构性表达，但它的表达在以细胞快速生长为特征的阶段是最高的。在非小细胞肺癌中，肿瘤增殖具有预后意义；最近的一项对108项研究的荟萃分析发现，在某些情况下，Ki67的表达与不良的肿瘤学结果之间存在一致的相关性。

尽管Ki67在NSCLC中的表达对预后的意义已被广泛研究，但肿瘤增殖活性与局部免疫微环境特征之间的关系尚不清楚。根据免疫微环境特征、治疗后结果和对免疫检查点抑制反应之间的已知关系，了解Ki67在多大程度上反映了免疫上有利或不利的TME，有助于指导有关治疗选择和时机的决策。此外，鉴于针对肿瘤和免疫细胞上表达的免疫检查点的治疗剂的开发和临床应用正在研究当中，描述目前为止尚不明确的肿瘤增殖活性和免疫抑制特征之间的关系是一个有待探索的临床重点研究方向。我们假设Ki67能量化的肿瘤增殖活性，并反映免疫抑制的微环境，那么反过来，它将与接受手术治疗的非小细胞肺癌患者化疗后的不良生存结果相关。

材料与方法

患者群体

1997年至2012年间接受手术且有准确信息的I期至III期的早期NSCLC，并有符合分析条件的病理Ki67表达数据的患者。从前瞻性维护的科室数据库中回顾性查询基线临床病理特征。由于新辅助治疗已被证明与TME的变化有关，接受新辅助化疗或放射治疗的患者被排除在外。肿瘤是使用第七版美国癌症联合委员会分期系统进行分期的。这项回顾性研究是在放弃知情同意的情况下仍由德克萨斯大学MD安德森癌症中心的机构审查委员会批准的。

免疫组织化学染色与图像分析

为了量化Ki67和免疫检查点的表达，使用前述的方法（18），使用福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤块构建组织微阵列。简而言之，使用从肿瘤中心、周边和中部获得的三个1.0 mm核心制备组织微阵列切片。使用自动染色系统(Bond-Max，Leica Microsystems，加利福尼亚州Vista)。在使用Aperio AT Turbo系统(徕卡微系统)以x200倍进行扫描后，专业训练的病理学家检查了扫描的图像(ImageScope，徕卡微系统)，并使用Aperio eSlide Manager(徕卡微系统)创建了数字组织微阵列块。以表达Ki67的肿瘤细胞百分比来量化肿瘤的增殖(Ki-67/克隆MIB-1[M7240]，稀释度1：100；加利福尼亚州达科，Carpinteria)。如上所述，在190例患者中，184例(96.8%)在肿瘤间质中检测到了主要表达于恶性肿瘤细胞上的检查点（ [PD-L1], B7-H3, B7-H4, [IDO1]）的细胞百分比，以及宿主肿瘤相关免疫细胞上表达的检查点（T细胞活化的V结构域抑制因子，肿瘤坏死因子受体超家族成员4，[ICOS]，[LAG3]，以及T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3）的细胞密度。对于一个有代表性的肿瘤亚群(171，90.0%)，该完整的肿瘤切片以前被用于量化表达分化簇的肿瘤相关免疫细胞群，用以往已采用已发表的方法，在肿瘤内(肿瘤巢和肿瘤间质)和瘤周间隔的5个1mm²区域内，使用完整的肿瘤切片来量化表达分化簇（CD3、CD4、CD8、CD57、颗粒酶B(GZB)、CD45RO、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)、叉头盒P3(FOXP3)和CD68）的肿瘤相关免疫细胞群。以人扁桃体组织为阳性(抗体染色)和阴性(未染色)对照。分别使用ScanScope Aperio A T Turbo扫描仪和ImageScope软件(均为Leica Microsystems)，扫描和可视化染色的幻灯片，并使用Aperio Image Toolbox(Leica Microsystems)对成像数据进行可视化和分析。

统计分析

用Spearman等级相关检验分析Ki67表达、免疫检查点和免疫细胞密度之间的关系(范围-1[完全负相关]到+1[完全正相关]，r=0表示没有相关性)。为了控制多重比较，使用错误发现率调整的P值(Q值)来评估由Ki67表达二分法的样本之间所有的成对相关性和标记密度分析。因为基于家庭的错误率方法是保守的，可能导致发现错误，所以我们选择使用错误发现率方法来识别尽可能多的重要关联（在增加I型错误率的限制下），同时控制错误阳性结果的发生率。使用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis检验评估了两组之间的Ki67表达差异。根据MC中Ki67的表达程度，生成热图以识别免疫检查点的有关共表达和免疫细胞浸润的模式。对于与Ki67有统计意义的成对相关的免疫检查点，通过拟合具有高斯分布和同一性联系的广义线性模型来进一步模拟关联，以说明相关的临床病理特征(年龄、性别、吸烟状况、组织学、分化程度、病理分期；采用Akaike信息标准进行最终模型选择)。总生存期(OS)定义为从手术到死亡的时间；或对于研究结束时还活着的患者记录到最后一次接触之日。无病生存(DFS)被定义为从手术到疾病复发或死亡的时间；没有DFS事件的患者记录到最后一次接触之日。采用单因素Cox比例风险回归分析临床病理参数与Ki67表达和OS的关系。单变量分析中P值小于.20的变量被包括在多变量模型中；然后执行逐步向后剔除，直到最终多变量模型中的所有变量满足P小于.10作为最终选择标准。中位随访时间计算为从手术到最后一次接触或死亡的中位时间。用Kaplan-Meier方法估计存活率，用logrank检验分析各组之间无事件-时间结局的差异。所有的分析都使用SPSS（24.0.0版；IBMArmonk，NY)和R(3.3.0版；http://www.r-project.org).使用R的本地热图函数生成热图。使用R的FindCut软件包确定能分辨术后OS的Ki67最佳截止值，该软件包根据Akaike信息判据方法确定最佳截止点的数目，并根据似然比检验确定最佳截断点的位置。

结果

患者和肿瘤特征

共有190名患者符合分析条件(图E1)。Most patients were men (102, 53.7%), 为早期疾病(病理I期：109例，57.4%)，行解剖肺叶切除术(170例，89.5%)(表1)。所研究的大多数肿瘤是腺癌(114例，60.0%)和高中分化肿瘤(110例，57.9%)。

肿瘤增殖与临床病理特征的关系

在男性(肿瘤细胞阳性细胞中位数23.1%；四分位数范围[IQR]，12.5-34.8)和女性(中位数21.0%阳性肿瘤细胞[10.6-35.3]，P.659)之间没有观察到Ki67的表达差异（图E2提供的研究队列中Ki67表达的分布)。吸烟者Ki67在肿瘤内的表达(中位数为24.6%的阳性肿瘤细胞[13.2~35.9])明显高于不吸烟者(中位数为11.4%的阳性肿瘤细胞[7.7~16.5]，P<0.001)。Ki67在鳞癌中的表达(中位数31.4%阳性肿瘤细胞[22.8~40.2])高于ACA(中位数15.2%阳性肿瘤细胞[9.0~26.4]，P<0.001)(图1)。对比I期(中位数20.8%[9.6~30.5])和II期(中位数19.2%[13.1~38.2]，P=025)的阳性表达率，Ki67在III期肿瘤中表达率最高(中位数为28.5%，阳性肿瘤细胞数为18.7~36.7)。同样，病理淋巴结受累与较高的Ki67相关(pN0中位数20.8%阳性肿瘤细胞[9.7~30.5]vsPN+中位数28.3%[16.5~38.5]，P=003)。低分化肿瘤(中位数28.8%阳性肿瘤细胞[20.6~38.0])的Ki67表达高于中、高分化者(中位数15.4%阳性肿瘤细胞[9.0~28.4]，P<0.001)。Ki67表达与病理肿瘤大小呈正相关(r=0.191，P=0.18)。

早期非小细胞肺癌肿瘤增殖与肿瘤和免疫细胞表面免疫检查点表达增强相关

肿瘤增殖活性与MC在肿瘤间隔区的几个免疫检查点的表达密切相关，包括PD-L1(r=0.287，P<.001)、B7H3(r=0.235，P=.006)和IDO-1(r=0.225，P=.008)(图2，A)。Ki67的高表达还与间质中肿瘤相关免疫细胞的LAG3的高表达相关(r=0.245，P=.004)。Ki67与共刺激分子ICos的表达增加呈弱相关性(r=0.175，P=.036)。以Ki67表达高于观察中位数为特征的肿瘤,在瘤内(中位数625.8个/mm²[IQR，365.8~931.2]vs 464.6[289.1687.1]，P=.032)和瘤周室中(1066.7[714.9~1519.5]vs 875.2[603.6~1124.1]，P=.043)表达抑制性检查点PD1的细胞密度增加。尽管在控制了相关临床病理特征后，Ki67的表达与B7H3或IDO1的表达没有独立的相关性，但其表达仍与PD-L1的肿瘤表达增加有关(P=.043)。

值得注意的是，巨噬细胞Ki67的表达与CD4(r=-0.208，P=.015)和CD57(r=0.220，P=.010)表达的细胞浸润成负相关。未观察到Ki67的表达与瘤室内CD8+细胞密度之间的相关性(r=0.125，P=.170)。在瘤周间隙，表达CD3(r=0.390，P<.001)、CD4(r=0.242，P=.008)、CD8(r=0.384，P<.001)、CD45RO(r=0.321，P<.001)、FOXP3(r=0.347，P<.001)和GZB(r=0.285，P＝002)的肿瘤相关免疫细胞浸润增加与Ki67表达相关(图2，B)。根据组织学分层后的亚组分析，Ki67与检查点表达的关系在ACAs中被保留，而在鳞癌中这些关系不符合统计学意义(表E1和E2)。根据病理分期分层后的亚组分析，Ki67表达和检查点表达在病理I期肿瘤中存在相关性，而在II和III期肿瘤中没有相关性(表E3),提示Ki67表达与免疫抑制微环境之间的关系在疾病的晚期可能不存在。

增殖指数增高与病理I期非小细胞肺癌切除术后生存期呈负相关

中位随访时间为70.0个月后，有121例死亡和123例DFS事件；全组中位生存期78.7月(95%置信区间50.5~106.9)个月，中位生存期62.1个月(95%置信区间37.5~86.7)个月。因为观察到Ki67的表达与病理分期之间存在交互作用(OS交互作用项P=.004；DFS交互作用项P=.002)，并且Ki67表达与晚期患者的生存无关,队列进行进一步仅限于病理I期疾病的分层分析(109/190例；死亡57例，发生DFS事件58例；MST 138.3个月，95%CI，104.2-172.4；中位DFS时间125.0个月，95%CI，84.0-166.1)。根据术后OS值,(≤7.17%7.17%至25.73%,≥25.73%,)来区分定义低危、中危和高危I期肿瘤(图3)。后分析证实PD-L1和IDO1在高Ki67肿瘤中的表达最高。同样，无论是在瘤内还是瘤周，表达抑制性检查点PD1的肿瘤相关免疫细胞，在高Ki67肿瘤中密度最高。多变量分析显示，Ki67表达与死亡风险增加(Ki67-HR 4.33，95%CI，1.00-18.67；Ki67HighHR 8.23，95%CI，1.91-35.41)和DFS事件(表E5和E6)(视频1)独立相关。

讨论

在这项对术后的非小细胞肺癌患者化疗相关的数据分析中，我们发现由Ki67计量代表的高肿瘤增殖活性与局部TME内肿瘤细胞和免疫细胞上的免疫检查点表达增强之间，存在关联，特别是在I期肿瘤。肿瘤高增殖活性与辅助T淋巴细胞(CD4)和自然杀伤细胞(CD57)在瘤内浸润减少有关，尽管它们也以瘤周炎性浸润增加为特征。最后，确定了病理I期疾病中Ki67的高表达的一个患者亚组，他们在切除后死亡风险显著增加。据作者所知，本研究首次描述了非小细胞肺癌肿瘤增殖与免疫抑制剂TME之间的关系。

巨噬细胞逃避免疫监视的能力在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。这一过程的关键是通过表达免疫检查点来抑制免疫反应，免疫检查点可以降低宿主免疫细胞的活性，并诱导淋巴细胞死亡。这些检查点可能通过独立的途径发挥作用，它们的共表达程度可能是分子亚型所决定的。尽管PD-L1/PD1轴几乎成为目前最密切受关注的配体-受体对，但IDO1(一种参与色氨酸分解代谢的酶)、跨膜免疫调节蛋白B7H3和淋巴细胞失活的LAG3的表达，已被证明在非小细胞肺癌中具有预测预后的意义。在NSCLC中，IDO1(一种参与色氨酸分解代谢的酶)、跨膜免疫调节蛋白B7H3和淋巴细胞失活的LAG3的表达，具有预后意义。针对这些检查站的治疗方法的探索正在进行中（28，29）。在本研究中，通过分析Ki67和几个免疫检查点的肿瘤表达，我们强调了免疫抑制的局部微环境与肿瘤快速增殖之间的关系。由于肿瘤生长和检查点表达分别提高了细胞毒治疗和免疫治疗的疗效，我们建议进一步探索Ki67表达的预示作用，作为非小细胞肺癌患者接受检查点抑制剂、细胞毒剂或其新组合疗法的预测性生物标志物。

在本研究中，Ki67强度与表达CD4/CD57（辅助T淋巴细胞和自然杀伤细胞的表面标志物）的细胞在肿瘤内浸润之间的负相关，支持了我们对肿瘤增殖和免疫抑制微环境之间的关系的观察。相反，以Ki67高表达为特征的肿瘤变现为瘤周间隙强烈炎症，其标志是表达CD3、CD4、CD8、CD45RO、FOXP3和GZB的各种免疫细胞密度增加。同样，表达T细胞刺激因子ICOS的肿瘤相关免疫细胞在高增殖肿瘤中表达增强。综上所述，这些发现提示，在瘤周间隙存在一定强度关于肿瘤生长活动的淋巴细胞反应，而这与免疫细胞不能渗透到瘤内间隙和肿瘤巢中的理论是矛盾的。考虑到恶性细胞和免疫细胞之间空间相互作用的重要性，免疫细胞浸润的相对间隔差异值得进一步研究。

在这个非小细胞肺癌切除并接受化疗的患者队列中，Ki67的表达对预后的影响受病理分期的影响，仅在I期患者中有预后意义。在I期疾病中，Ki67与免疫抑制微环境的关系比在更晚期的疾病中更密切，这一观察结果为不同病理阶段的不同预后意义提供了可能的机制解释。与此观察一致的是，先前的几项分析已经确定了I期非小细胞肺癌患者肿瘤增殖与术后生存率之间的关系。此外，通过对我们机构的I期患者队列进行三分法分析，我们确定了一个亚组，该亚组由一个易于应用的分界点进行筛选(Ki67在的肿瘤细胞中表达占25%)，术后生存率接近历史上观察到的II期疾病。瘤内Ki67的表达对于I期肿瘤是否代表很高的治疗失败风险，从而证明使用辅助治疗是合理的，这是一个值得进一步研究的主题。

研究局限性

尽管这项研究受到回顾性研究的限制，但较长的随访期允许将相对低风险疾病的患者区分为三个不同的风险层次。虽然我们关于肿瘤增殖和检查点表达关联的发现很有趣，因为它们可能应用于免疫检查点抑制剂的治疗背景，但我们的分析仅限于没有接受新辅助治疗的患者。目前还不清楚暴露于以前的治疗和潜在的克隆选择可能会对这些关系产生什么影响。需要进一步的研究来阐明这些关于疾病从局限性向晚期进展有关的发现，是否基于肿瘤生物学改变的背景。此外，由于队列是基于Ki67表达数据可获得的前提确立的，一小部分缺乏其他免疫组织化学数据，研究队列只反映了在研究期间在我们机构接受手术的所有非小细胞肺癌患者中的一小部分。最后，肿瘤组织学分层的探索性分析表明，这些关联在鳞状细胞癌中不存在。这一观察结果值得进一步调查。由于生物标记物是为了预测或早期诊断非小细胞肺癌而开发的，为组织病理亚型量身定做的几个标记物可能是最好的方法。病理分期分层后，在II期和III期肿瘤中，Ki67表达与免疫检查点无相关性。需要进一步分析在新辅助治疗和辅助治疗环境中使用新疗法的试验，以确定这种明显的阶段特异性关系的临床意义。

总结

我们确定了肿瘤增殖活性与Ki67的肿瘤表达和侵袭性肿瘤生物学相关的特征之间的关系。此外，快速增殖的肿瘤与高强度的间质炎症反应相关，但肿瘤腔室中几个细胞群的浸润减少。这些结果强调了在未来进一步研究的必要性，以确定预处理的Ki67计量是否可以作为对新疗法反应的预测标志。

原文题目：Tumor cellular proliferation is associated with enhanced immune checkpoint expression in stage I non–small cell lung cancer