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图1. 食管鳞癌患者生存率低和肿瘤中高M2巨噬细胞浸润与FOXO1过表达有关

(A) qRT-PCR检测52对ESCC和癌旁样本中FOXO1的表达量, 在肿瘤组织中FOXO1表达组织上调。

(B) FOXO1在ESCC和癌旁组织中表达的代表IHC图像。比例尺200μm(左图)和50μm(右图)，FOXO1在肿瘤边缘持续高表达。

(C) 对48名FOXO1阳性表达患者和96名FOXO1阴性表达患者的总生存Kaplan-Meier生存分析表明FOXO1阳性表达与预后不良相关。

(D) 通过RNAseq数据分析3种ESCC组织中22种免疫细胞浸润的热图。列代表3个样本，红色代表浸润程度高，绿色为浸润程度低。记忆T细胞、单核细胞、M2巨噬细胞浸润较高。

(E-F) TCGA数据库中根据ESCC患者FOXO1表达分为两组，分析高表达组30名和低表达组17名患者CD206(E)和CD163(F) mRNA表达，FOXO1高表达的患者CD206和CD163均高表达。

(G) FOXO1阳性和FOXO1阴性表达肿瘤组织中的FOXO1(棕色)和CD68(红色)IHC染色的代表图像，比例尺为50μm。

(H) FOXO1阳性和FOXO1阴性表达肿瘤组织中的FOXO1(红色)和CD206(绿色)IF染色的代表图像，比例尺为100μm(左图)和50μm(右图)。

图2 在小鼠中建立M2巨噬细胞浸润模型，即将FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤细胞分别注入裸鼠两侧，3周后取肿瘤组织

(A) FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤组织中CD68的IHC染色代表图像，比例尺为50μm，FOXO1(+)肿瘤组织中CD68+巨噬细胞浸润显著多于FOXO1(-)。

(B) qRT-PCR检测5对FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤组织中CD68比Beta-actin的相对表达量，在体内观察到FOXO1促进巨噬细胞浸润。

(C) FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤组织中的FOXO1(红色)和CD206(绿色)IF染色的代表图像，比例尺为50μm。

(D) qRT-PCR检测5对FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤组织中CD206比Beta-actin的相对表达量，说明肿瘤组织中浸润的巨噬细胞主要为M2亚型。

(B和D) *表示P<0.05, **表示P<0.01。

图3 FOXO1(+)肿瘤细胞通过分泌CCL20募集M2巨噬细胞

(A) qRT-PCR检测FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤细胞中CCL20相对Beta-actin的表达量。

(B) 用ELISA法测定FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤细胞上清中CCL20的浓度。

(C) Western印记检测FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤细胞CCL20相对Beta-actin蛋白表达水平。

(D) Western印记检测FOXO1(+)细胞及沉默其FOXO1表达后细胞中CCL20和FOXO1蛋白水平。

(A-D) FOXO1(+)肿瘤细胞高表达CCL20，而用shRNA沉默FOXO1表达时，CCL20的上调会被逆转，说明CCL20可能是FOXO1下游的分子。

(E) 使用0.25μg/mL和1.0μg/mL的α-CCL20抗体处理FOXO1(+)肿瘤细胞后及FOXO1(-)肿瘤细胞的M2巨噬细胞迁移试验的代表图像(比例尺为100μm)和总迁移数。

(F) 无血清培养基、5ng/mL和20ng/mL重组CCL20培养诱导M2巨噬细胞迁移试验的代表图像(比例尺为100μm)和总细胞数。

(G) 沉默FOXO1表达(sh1和sh2)及对照(Ctl)的FOXO(+)细胞诱导M2巨噬细胞迁移试验的代表图像(比例尺为100μm)和总迁移数。

(E-G) 重组CCL20能增加M2迁移，使用CCL20抗体或沉默FOXO1表达均引起M2迁移减少。

(B, C, E, F和G) *表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001, ****表示P<0.0001。

图4 FOXO1(+)肿瘤细胞通过分泌CSF-1促进M0向M2巨噬细胞分化

(A) 流式细胞分析与0.2μg/mL和1.0μg/mL的α-CSF-1抗体处理FOXO1(+)肿瘤细胞及FOXO1(-)肿瘤细胞共培养的M0巨噬细胞CD68和CD163的表达，柱状图表示M2巨噬细胞占M0的百分比，为三次独立实验结果的平均值±标准差(误差条)，与FOXO(+)肿瘤细胞共培养会增加M0中M2的百分比，抗CSF-1处理显著降低M2巨噬细胞的百分比。

(B) 流式细胞分析与沉默FOXO1表达(sh1和sh2)及对照(Ctl)的FOXO(+)细胞共培养的M0巨噬细胞CD68和CD163的表达，柱状图表示M2巨噬细胞占M0的百分比，为三次独立实验结果的平均值±标准差(误差条)，沉默FOXO1导致肿瘤细胞诱导M2极化的能力受损。

(C) 热图展示FOXO1(-)和FOXO1(+)肿瘤细胞诱导M0巨噬细胞的M2巨噬细胞标记物(CD206、CD163、IL10、CCL18、CLEC7A和STAT6)以及泛巨噬细胞标记物CD68的表达水平(通过qRT-PCR测定)。蓝色表示下调，红色表示上调，颜色深浅反映mRNA的表达值。FOXO1能诱导M0向M2巨噬细胞转化。

(D-E) GSEA分析显示与初始M0(D)以及FOXO1(-)诱导的M0(E)相比，GSEA_WT_VS_STAT6_KO_MACROPHAGE_IL4_STIM通路在FOXO1(+)诱导的M0巨噬细胞中被富集到，在FOXO1(+)和FOXO1(-)诱导的M0之间的标准富集评分(NES)更高(2.16)，FOXO1(+)诱导的M0巨噬细胞与IL4刺激的M2巨噬细胞有相似的分子特征。

(F)  qRT-PCR检测FOXO1(-)和FOXO1(+)肿瘤细胞中CSF-1的相对表达水平。

(G) 用ELISA法测定FOXO1(-)和FOXO1(+)肿瘤细胞上清中CSF-1的浓度。

(H) Western印记检测FOXO1(+)和FOXO1(-)肿瘤细胞CSF-1相对Beta-actin蛋白表达水平。

(I) Western印记检测FOXO1(+)细胞及沉默其FOXO1表达后细胞中CSF-1和FOXO1蛋白水平。

(F-I) FOXO1(+)肿瘤细胞CSF-1表达显著上调，而用shRNA沉默FOXO1表达时，CSF-1的上调会被逆转，亦说明CSF-1可能是FOXO1下游的分子。

(J) 使用ChIP-qPCR对CSF-1启动子区域结合FOXO1的共沉淀DNA进行定量分析，FOXO1抗体有效沉淀了CSF-1启动子。

(K)  qRT-PCR检测用100μg/μL重组CSF-1刺激的M0巨噬细胞和对照组M0中M2型巨噬细胞标志物的相对表达，刺激CSF-1后，CD206、CD163和CCL18表达上调。

(L) 流式细胞分析用PBS、25μg/μL CSF-1和100μg/μL重组CSF-1处理的M0巨噬细胞CD68和CD163的表达，柱状图表示M2巨噬细胞占M0的百分比，为三次独立实验结果的平均值±标准差(误差条)，CSF-1增加了M2巨噬细胞的百分比。

(A, B, F, G, J和L) *表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001, ****表示P<0.0001。

图5 M2巨噬细胞通过FAK/PI3K/AKT信号转导通路促进肿瘤细胞增殖和迁移

(A) XTT法检测M2培养上清或对照处理若干天后肿瘤细胞的细胞活力，肿瘤细胞的增殖率增加。

(B) 柱状图展示使用M2培养上清和对照处理肿瘤细胞形成的病灶数目，增强了肿瘤细胞集落形成能力。

(C) M2培养上清和对照处理后Ki67+肿瘤细胞IF的代表图像，下方柱状图为相应的数量均值和标准差，细胞增殖标志物Ki67+多于对照组。

(D) M2培养上清和对照处理的肿瘤细胞注射进小鼠若干周后切下的肿瘤体积，即对肿瘤的生长速度的影响，每组5只小鼠。

(A-D) M2巨噬细胞能显著促进肿瘤细胞增殖。

(E) Western印记显示M2培养上清刺激肿瘤细胞0/24/48h后，FAK-PI3K-AKT通路关键蛋白水平，FAK、PI3K和AKT磷酸化增强，该信号通路被激活。

(F)  Western印记显示M2培养上清刺激后用DMSO或LY294002处理的肿瘤细胞中AKT磷酸化程度(RID: 相对积分密度)，PI3K抑制剂LY294002能阻断该通路，即抑制AKT的激活。

(G) 柱状图展示使用M2培养上清联合DMSO或LY294002处理肿瘤细胞形成的病灶数目。

(H) XTT法检测M2培养上清联合DMSO或LY294002处理后肿瘤细胞的细胞活力。

(I) M2培养上清联合DMSO或LY294002处理后Ki67+肿瘤细胞IF的代表图像，右侧柱状图为相应的数量均值和标准差。

(G-I) PI3K抑制剂LY294002能阻碍M2诱导肿瘤细胞增殖。

(J) Western印记显示CCL18和β-actin在M0和M2巨噬细胞中的表达情况，CCL18由M2巨噬细胞分泌。

(K)  Western印记显示PBS、20ng/μL和100ng/μL重组CCL18激活肿瘤细胞的FAK-PI3K-AKT通路，CCL18激活该通路。

(A, B, C, D, G, H和I) *表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001, ****表示P<0.0001。